Les expériences qui ont été réalisé sont : - L'extraction de l'ADN de salive - L'électrophorèse de l'ADN de saumon
Dans la réalité des faits, la police scientifique lorsqu’elle cherche à identifier un coupable procède à une extraction et à une
électrophorèse* sur une même molécule d’ADN prélevé sur la scène de crime et en parallèle sur les suspects.Nous souhaitons préciser que de par l’impossibilité pour nous de procéder à l’expérience complète d’identification de la molécule sur du matériel humain, nous avons décider de : - procéder à l’extraction de l’ADN sur la salive d’un camarade de classe - de procéder à l’électrophorèse sur du matériel animal.
Pour obtenir le « code barre » de l’ADN, il faut avant tout, l’extraire.Pour nous entraîner, nous avons mené l’expérience sur une échalote. Plus à l’aise avec le protocole, nous avons travaillé à partir de la salive d’un camarade de classe : Paul-Marie OLIVA.L’électrophorèse à été réalisée avec des solutions d’ADN de phage λ digéré par différentes
enzymes de restrictions*.
1. Protocole de l’extraction d’ADN de salive :
Matériel :
(photo n°2) - liquide vaisselle - agitateur magnétique et barreau aimanté - tubes à essais froids - filtre - entonnoir - pipette jaugée - eau salée froide - deux bechers froids - salive d’une personne - éthanol
Manipulation :
Après avoir mis 50 mL de salive dans un bécher, nous ajoutons une cuillère à café d’eau salée. Nous agitons à l’aide de l’agitateur magnétique et du barreau aimanté. Environ deux minutes après, nous ajoutons deux à trois gouttes de liquide vaisselle
(photo n°3). Nous agitons environ trois à cinq minutes jusqu’à ce que la mousse se stabilise
(photo n°4).
Pendant ce temps, nous avons posé sur un tube à essais, l’entonnoir habillé d’un filtre
(photo n°5).Nous versons la préparation du bécher (salive, eau salée et liquide vaisselle) dans l’entonnoir
(photo n°6). Nous obtenons un liquide opaque.
A l’aide d’une pipette, nous ajoutons autant d'éthanol que de préparation dans le tube à essai
(photo n°8).
Résultats :
Nous apercevons une méduse d’ADN se soulever pour aller se nicher à la surface de l’éthanol
(photo n°9).L’expérience est un succès. L’ADN à été isolé.
2. Préparation de l’électrophorèse :
Mme V. MARREL, aide-laborantine à Notre-Dames des Victoires, a préparé pour nous : - Le tampon TBE - Le gel de migration - L’ADN de phage λ
Préparation du tampon TBE :
Matériel : - 100 mL de tampon TBE10x à pH=8,3 - 900 mL d’eau déminéralisée
On ajoute les 900 mL d’eau déminéralisée au 100 mL de tampon TBE10x. Il y a donc 1000 mL de tampon TBE.
Préparation du gel de migration :
Matériel :
- Tampon TBE 1,6g d’
agarose* - Un erlenmeyer Pour 100 mL de tampon TBE, il faut 0,8g d’agarose qu’il faut mélanger dans un erlenmeyer.Pendant 2 à 3 minutes, nous le passons au micro-ondes à la puissance de 1000W.Le gel doit être sans grumeaux et d’épaisseur de 4 à 5 mm.IL faut ensuite couler le gel, refroidit aux alentours de 55°C, dans un moule composé d’un peigne qui déterminera les puits de dépôt.
Préparation des différentes solutions d’ADN du phage λ :
Matériel :
- Solution d’ADN de phage λ digéré par EcoR1 - Solution d’ADN de phage λ digéré par HindIII - Solution d’ADN de phage λ digéré par EcoR1 + HindIII - Bleu de dépôt
Tout d’abord, le bleu de dépôt est constitué de bleu de bromophénol et de xylène cyanol, ce qui alourdit les séquences d’ADN et va permettre aux solutions d’ADN de mieux couler dans les puits.
Il faut ajouter 13 µL de bleu de dépôt pour 100 µL de solution d’ADN de phage λ.Il faut changer de cône pour les pipettes a chaque ajout de bleu de dépôt et agiter par mouvement circulaire avec la pointe du cône pour que le bleu de dépôt se mélange bien à l’ADN. ATTENTION : Il ne faut pas agiter brusquement car la molécule d’ADN se casse facilement.
C’est là que le vrai travail commence !
Pour l’électrophorèse de l’ADN :
Matériel :
- Table d’électrophorèse constituée d’une cathode ainsi qu’une anode pour le courant. - Cuve de gel avec le peigne - bleu de dépôt - 2 solutions d’ADN de phage λ digéré par Eco R1 (appelées : EcoR1 et λ / EcoR1) - 2 solutions d’ADN de phage λ digéré par HindIII (appelées : HindIII et λ / HindIII) - 2 solutions d’ADN de phage λ digéré par EcoR1 + HindIII (appelées : EcoR1 + HindIII et λ / EcoR1 + HindIII) - micro-pipette avec plusieurs cône à disposition - cuve remplie de bleu d’Azure A
Manipulation :
Pour commencer, nous avons mis la cuve composée de gel sur la table d’électrophorèse, puis nous avons retiré le peigne afin de découvrir les puits.Pour que les puits soient bien visibles, nous avons placé une feuille de canson noir sous la table d’électrophorèse. Les dépôts se font dans les puits, du côté cathode car la migration se fait vers l’anode.Avec la micro-pipette, nous déposons 20 µL de chaque solution dans les différents puits, dans l’ordre suivant :
(Vidéos sur les dépôts) - puit 1 : EcoR1 - puit 2 : HindIII - puit 3 : EcoR1 + HindIII - puit 4 : λ / HindIII - puit 5 : λ / EcoR1 + HindIII - puit 6 : λ / EcoR1 - puit 7 : EcoR1 - puit 8 : λ / HindIII - puit 9 : λ / EcoR1 - puit 10: HindIII
La migration doit avoir lieu juste après les dépôt. Pour cela, nous avons branché la table d’électrophorèse au générateur puis nous avons fait migrer pendant 45 minutes à 90 volts.
(Vidéo illustrant le branchement)Le bleu de dépôt présent dans les solutions, permet de suivre la migration (on peut juger grâce à cela, le moment opportun pour arrêter la migration).
Vidéo concernant la migrationA la fin de la migration, après avoir débranché, nous avons délicatement sorti le gel de la table d’électrophorèse et de sa cuve.Nous avons ensuite immergé le gel dans la cuve de colorant Azure A pendant 5 minutes en agitant légèrement.
Nous avons éliminé l’excès de colorant à la surface avec quelques millilitre d’alcool à 70°. Pour éliminer totalement le colorant et l’alcool, nous avons rincé le gel plusieurs fois à l’eau du robinet.
Quelques minutes après, nous voyons apparaître des bandes, quelques heures après, elles sont nettement visibles.
Le principe de l’électrophorèse est utilisé par le laboratoire de la police scientifique pour confondre l’ADN retrouvé sur la scène de crime, de cambriolage ou autre à celui des suspects.
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